Lácteos Seguros - Análises de Rotina do Leite - Parte III

Pesquisa de Fosfatase Alcalina

A enzima fosfatase alcalina ou fosfomonoesterase alcalina, que está sempre presente no leite cru, catalisa a

hidrólise de fosfatos orgânicos (ésteres), liberando ácido fosfórico e fenol. Essa fosfatase é inativada pela exposição às temperaturas de pasteurização de 61.7°C/30 minutos e 71,1°C/15 segundos.

Se o tratamento térmico situar-se abaixo dessas especificações, alguma fosfatase residual permanecerá ativa e, sob condições de laboratório cuidadosamente controladas, libera fenol a partir de uma solução tamponada de fenilfosfato dissódico, em pH aproximadamente 9,6, que é o ótimo para a atividade de enzima. A presença de fenol livre é determinada por um teste colorimétrico. O leite corretamente pasteurizado produzirá uma solução levemente cinza ou relativamente desprovida de coloração, enquanto que o leite cru e o leite insuficientemente pasteurizado produzirão soluções de cor azul (mais e menos intensa, respectivamente). O analista deverá ter cuidado com a vidraria, rolhas de borracha e outros materiais com os quais as amostras e reagentes podem entrar em contato durante o teste, visando eliminar qualquer traço de fosfatase, fenol ou outras substâncias interferentes. Isso requer que todos os tubos, pipetas, funis, frascos de reagentes, rolhas de borracha, etc, tornem-se livres de qualquer tipo de agente de superfície, evitando-se o emprego de desinfetantes.

Como precaução adicional, manter todo esse material em banho a 82°C no mínimo por dez minutos pouco antes do seu uso. Evitar o emprego de frascos de plástico, por causa do risco de contaminação fenólica. O leite pasteurizado não pode ter nenhum contato com quaisquer utensílio ou equipamentos que tiveram contato com leite ou creme crus, já que estes poderão introduzir fosfatase suficiente para produzir teste positivo mesmo num leite corretamente pasteurizado.

Como cerca de 30-40% da fosfatase encontra-se adsorvida pela membrana lipoprotéica, dos glóbulos de gordura, o processo de padronização ou desnate do leite causa a sua partição em favor do creme e da manteiga, concentrando-se nesses produtos. Conseqüentemente, a adição de creme cru a qualquer produto, produzirá resposta mais acentuada ao teste do que a adição do mesmo volume de leite. A prática demonstra que o creme pasteurizado e com resposta negativa ao teste de fosfatase, após ter sido estocado por vários dias a 4°C, pode voltar a apresentar resposta positiva. 

Isso deve ao fato de que algumas cepas de Bacillus Cereus e Bacillus mesentericus, bactérias formadoras de esporos, são capazes de produzir fosfatase. A fosfatase bacteriana é mais resistente ao tratamento térmico do que a natural do leite, suportando 76,7°C/30 minutos. A presença de fosfatase bacteriana pode ser diferenciada da fosfatase alcalina do leite através do aquecimento da amostra de creme a temperaturas acima daquelas usadas para sua pasteurização lenta (66°C), mas abaixo de 76,7°C, com posterior realização do teste da maneira usual.

Em vista da possibilidade de formação de fosfatase microbiana, ou fenol, ambos por ação de microrganismos no creme, torna-se evidente que um teste positivo para amostras no produto estocado não pode constituir prova conclusiva de pasteurização inadequada.

A fosfatase alcalina do leite tratado pelo método HTST pode também sofrer reativação com o decorrer do tempo, devido à oxidação dos grupos sulfidrílicos da molécula. Entretanto, as temperaturas requeridas para induzir tal reativação são bastante altas (91°C/16 seg. para leite integral a 102°C/16 seg. para o leite desnatado), bem como o período de incubação para que tal aconteça é excessivamente longo (32°C/6 horas para o leite integral e 32°C/18 horas para leite desnatado). O método LTLT (63°C/30 min.), por outro lado, desnatura completa e permanentemente a enzima.

Os tratamentos UHT (ex: 141°C/7 seg) resultam em variados graus de reativação da fosfatase alcalina, dependendo de fatores tais como temperatura de aquecimento, período de retenção e teor de gordura do leite.